У молекулярній біології, хороший вибір буфера і підготовка до різних кроків ізоляції ДНК може бути різницею між переходом на експресію білка або відкриттям ще одного комплекту макси-препа, щоб почати все спочатку. Незважаючи на їх вирішальне значення, буферні рецепти часто є саме такими рецептами, написаними без пояснення або обґрунтування для різних компонентів. Одним з таких буферів є глюкозо-трис-ЕДТА або буфер ГТД.
$config[code] not foundДля чого використовується GTE?
GTE використовують для ресуспендування бактеріальних клітинних гранул перед лизированием (розкриттям) клітин і збиранням плазмідної ДНК всередину. Лізоцим, який пом'якшує мембрани клітин, часто додають разом з буфером ГТД. Досягнення гомогенної суспензії цілих клітин протягом цього етапу так, щоб потім доданий розчин для лізису може потрапити до всіх клітин, є ключовим для отримання хороших виходів ДНК. GTE призначений для цього, забезпечуючи при цьому стабільне середовище для ДНК.
Глюкоза для осмолярності
50 мМ (мілімолярний) цукор глюкози додають до буфера ГТД для підтримки осмолярності, де концентрація розчиненої речовини поза клітинами близька до концентрації всередині клітин. Це запобігає передчасному лізису клітин, що може викликати зниження врожайності ДНК внаслідок агрегації та деградації. Інші компоненти буфера також сприяють осмолярності розчину, але глюкоза, будучи неелектролітом, є гарним вибором, оскільки вона не заважає буферним властивостям розчину.
Трис для стабільності рН
Трис - це коротка назва трис (гідроксиметил) амінометану, який є дуже поширеним буфером рН. У разі буфера GTE, кислотну сіль (Tris-HCl) додають до буфера в концентрації 25 мМ. Це підтримує рН розчину при майже фізіологічному 8,0, ідеальному рН для запобігання кислотного гідролізу (деградації) плазмідної ДНК і небажаних побічних реакцій інших клітинних компонентів.
ЕДТА запобігає деградації ДНК
ЕДТА, або етилендіамінтетраоцтова кислота, захоплює або «хелатує» іони металів з розчину, перешкоджаючи їм брати участь у небажаних побічних реакціях. В буфері GTE додають EDTA при 10 мМ. Її основна мета полягає в буфері для округлення вільного цинку, магнію і кальцію, тим самим запобігаючи деградації ДНК певними шляхами, які потребують цих металів.
Деякі важливі поради
Тримайте ваш буфер ГТД холодним і зробіть його в невеликих кількостях, щоб запобігти зростанню ненавмисних бактерій у ньому. Цукор і контрольований рН роблять для великої ростової середовища. Завжди використовуйте очищену воду. Водопровідна вода може мати надлишок іонів металів з труб, що може перевантажити здатність EDTA захопити. Якщо ви підозрюєте, що в вашому зразку існує перешкоджаюча РНК, додайте RNase A на 100 мікрограмів на мілілітр до вашого буфера GTE для усунення проблеми.
